Le retable femé représente la Crucifixion encadrée par les images de saint Sébastien à gauche et saint Antonin à droite. Sous la scène centrale, la prédelle montre une mise au tombeau. Si la représentation de la Crucifixion est courante sur les retables, le traitement qu'en fait Grünewald est caractérisé par le dépouillement de la scène réduite à quelques acteurs et la violente émotion qui s'en dégage. Sur un ciel presque noir se détachent le Christ crucifié, Marie soutenue par saint Jean, Marie-Madeleine, saint Jean-Baptiste et l'agneau pascal. Pour exprimer l'intensité exceptionnelle de la scène, Grünewald utilise des notations relevant les unes d'un réalisme morbide (le corps du Christ porte les marques de la flagellation, y compris les épines ; les clous déchirent ses mains et ses pieds) les autres d'une suggestion non réaliste (le corps du Christ, grandi jusqu'à la démesure, fait ployer la traverse de la croix). C'est le moment tragique de la mort du Christ dont la tête vient de retomber sur le côté alors que la bouche entr'ouverte, aux lèvres bleuies, semble encore chercher un peu d'air. Au pied de la croix, Marie, silhouette cassée, rejetée en arrière, est soutenue par saint Jean, l'apôtre préféré, visage crispé par la douleur. Marie-Madeleine, agenouillée, joint ses mains en avant dans un geste de déploration. De l'autre côté de la croix, saint Jean-Baptiste, solidement campé sur ses jambes, ne participe pas au violent désespoir des autres personnages. Déjà mort au moment du drame, il n'en est pas un acteur mais un témoin qui réapparaît pour rappeler l'accomplissement de la prophétie rapportée par l'Evangile de Jean que Grünewald a reproduite au-dessus de son index pointé vers le Christ : ILLUM OPORTET CRESCERE. ME AUTEM MINUI. (Il faut qu'il croisse et que je diminue). La prophétie évoque le passage du monde de l'âge de la Loi dans l'âge de la Grâce, de l'Ancien au Nouveau Testament. Saint Jean-Baptiste est accompagné de l'agneau qui saigne dans le calice, élément traditionnel de son iconographie.
     
      La crucifixion est encadrée par des représentations de saint Antoine et de saint Sébastien qui rappellent, l'un que le retable était destiné à un couvent d'Antonins, l'autre la principale occupation de ceux-ci. Saint Sébastien qui avait triomphé de son martyr par les flèches était invoqué par les fidèles pour les protéger de la peste dont on pensait qu'elle se propageait par des flèches invisibles. La couronne du saint est tenue au-dessus de lui par des anges. Saint Antoine, patron de l'ordre, tient le bâton d'abbé auquel le peintre a donné la forme du tau. C'est un personnage dont la monumentalité, soulignée par son manteau rouge, exprime la sérénité face aux attaques du démon rappelées dans l'angle supérieur droit.

     La première ouverture du retable est constituée de quatre panneaux qui représentent, de gauche à droite, l'Annonciation, la Nativité et le concert des anges, la Résurrection. L'Annonciation se déroule dans une église gothique du type de celles de la région du Rhin supérieur. Grünewald évoque l'apparition soudaine de l'Ange Gabriel par le mouvement de son manteau qui se relève de façon peu réaliste, tandis qu'on ne sait pas si ses pieds touchent effectivement le sol. Dominant la Vierge de sa grande taille, il surprend la jeune fille au moment où elle médite la prophétie d'Isaïe ; on peut lire sur le livre ouvert devant elle, au centre de la scène : ECCE VIRGO CONCIPIET ET PARIET FILIUM ET VOCABITUR NOMEN EUIS EMMANUEL (une vierge sera enceinte, elle enfantera un fils et il sera appelé Emmanuel). La scène représente donc le moment précis où la prophétie se réalise. Dans l'angle supérieur gauche, le peintre a représenté le prophète Isaïe.

     La Nativité occupe les deux panneaux centraux de la première ouverture. C'est une nativité originale, sans étable, sans âne ni bœuf. Assise dans un jardin clos qui rappelle sa virginité, Marie, à la fois monumentale dans sa robe rouge, et tendre, tient l'enfant Jésus dans ses bras. Une émotion intense se dégage de ses gestes et surtout des regards qui plongent l'un dans l'autre. La scène est dominée par une vision cosmique où Grünewald esquisse Dieu le Père dans une mandorle dorée au milieu d'une foule d'anges. La musique céleste est évoquée sur le panneau de gauche, dans une construction merveilleuse aux colonnes décorées de fleurs et de feuillages où les anges musiciens ont pris place. Cependant, la réalité de l'Incarnation est rappelée par le lit, le baquet et le pot de nuit disposés aux pieds de la Vierge. Le destin tragique qui attend l'enfant semble déjà annoncé par les langes déchirés qui évoquent le pauvre vêtement du Christ sur la croix.
    
      Le traitement de la Résurrection n'est pas moins original que celui de la nativité. Grünewald délaisse la description naturaliste de la sortie du tombeau au profit de l'expression d'un mouvement puissant. Seule l'extrémité du linceul est encore dans le tombeau ouvert tandis que Christ s'élance en l'air, comme libéré de toute attache terrestre. La lumière jaillissant de ses mains, de ses pieds et du côté, il apparaît dans un halo doré. Par cette situation entre ciel et terre, par cette illumination, Grünewald traduit picturalement le verset de L'Evangile de Matthieu (17.2) : " Et il fut transfiguré devant eux. Et sa face brilla comme le soleil ". Cette représentation associe Résurrection, Ascension et Transfiguration. 

     La deuxième ouverture du retable comprend un corps central sculpté encadré par deux panneaux peints. Exécutée par Nicolas de Haguenau en 1490, la partie sculptée est une des œuvres majeures du gothique tardif sur le Rhin supérieur. Au centre, saint Antoine est assis en majesté. A ses pieds, deux porteurs d'offrandes, un paysan apportant un coq, un bourgeois un cochon. A gauche est représenté saint Augustin dont les Antonins avaient adopté la règle ; à ses pieds, le précepteur de l'ordre, Jean d'Orlier. A droite est représenté saint Jérôme ; biographe de saint Paul l'ermite, c'est par lui qu'est connue la visite de saint Antoine à saint Paul. A la prédelle, le Christ et les Apôtres. 
     
      Sur le panneau latéral gauche Grünewald a représenté la visite de saint Antoine à saint Paul qui passait pour être le plus vieil ermite. Le visage austère et l'ample manteau du premier contrastent avec les traits sereins bien que vieillis et la tunique de feuille de palmier tressées du second. Le peintre a choisi d'illustrer le moment où, selon la Légende dorée de Jacques de Voragine, le corbeau qui apportait chaque jour du pain à saint Paul, miraculeusement averti, apporte ce jour-là double ration. Sur le panneau de droite, Grünewald a représenté la tentation de saint Antoine, connue par le récit merveilleux de saint Athanase d'Alexandrie. Battu par les démons, le saint a la vision d'une clarté admirable (la figure de divine apparaît dans un halo doré) qui met en fuite les bêtes féroces et guérit saint Antoine. Ayant reconnu la présence de Jésus il dit : " Où étiez-vous, bon Jésus ? Que n'étiez-vous ici dès le commencement pour me prêter secours et me guérir de mes blessures ! "

     On ne sait pas comment le retable était habituellement présenté. La statue de saint Antoine était-elle directement offerte à la contemplation des malades qui venaient à Issenheim ? Les volets étaient-ils progressivement ouverts pour leur faire effectuer un parcours de méditation ? Une signification d'ensemble du retable a pu être proposée : " Comme le Christ est passé par la mort et en est sorti vainqueur, comme saint Antoine a subi des épreuves et les a traversées, le malade doit espérer trouver une issue dans sa lutte contre le mal " (Christian Heck, ancien conservateur du musée d'Unterlinden).